Project

Artificiële nucleotiden in PCR

Een aanzienlijk deel van de diagnostiek bij Wageningen Bioveterinary Research (WBVR) wordt gedaan met PCR. Meestal wordt voor elke test een aparte PCR uitgevoerd. Wanneer meerdere PCRs in één reactie kunnen worden uitgevoerd (multiplex PCR), zou dat de moleculaire diagnostiek eenvoudiger en efficiënter maken. Dit voorstel beschrijft onderzoek naar de mogelijkheden van multiplex PCR.

Tijdens PCR worden specifieke stukken DNA (of RNA) van het doelwit (bacterie, virus) vermeerderd met behulp van kleine stukjes DNA (primers). Het komt voor dat, ondanks een theoretisch goed ontwerp, primers onbedoeld aan elkaar plakken (dimeren), waardoor een PCR inefficiënt wordt. De kans daarop is bij een multiplex PCR vele malen groter dan bij een gewone PCR. Het ontstaan van ongewenste dimeren kan worden voorkomen door samengestelde primers te gebruiken die groten­deels uit natuurlijk DNA bestaan, en voor een klein deel uit synthetisch DNA (artificiële nucleotiden). Een tweede complicatie die kan optreden tijdens multiplex PCR is competitie tussen de verschillende reacties. Dit kan deels worden ondervangen door de reacties onder optimale reactiecondities uit te voeren met speciaal daarvoor ontworpen reactiemixen.

Tests met drie multiplex PCRs

Voor drie groepen agentia zijn PCRs uitgekozen die als multiplex PCR zullen worden getest met samen­gestelde primers en onder aangepaste condities. Dit zijn drie PCRs voor aviaire influenza (detectie en H5/H7-typering), twee voor detectie van klassieke en Afrikaanse varkenspest, en drie voor detectie en typering van Salmonella. Naast zaken als gevoeligheid en specificiteit van deze drie multiplex PCRs, zal in dit project aandacht worden besteed aan een aantal praktische zaken die in overeenstemming moeten zijn met de bij WBVR bestaande logistiek om multiplex PCR op termijn in te kunnen zetten.

Binnen WBVR is beperkte ervaring met multiplex PCR. Als de voorgestelde inventariserende studie positieve resultaten oplevert, kan de opgedane expertise ingezet worden voor het invoeren van multiplex PCRs, en daarmee de capaciteit en throughput van de moleculaire diagnostiek vergroten.

Publicaties