onderzoek

Project

In situ proteoom array

In aanvulling op veel gebruikte DNA microarray platforms om variaties in het transcriptoom of genoom vast te stellen is er een sterke behoefte aan een platform om het proteoom te kunnen screenen op bv antigeniciteit of eiwit-interactie partners.

Doelstelling

Zulke proteoom breed geselecteerde varianten zijn interessant voor pathogenese, multi-diagnostiek of vaccin ontwikkelingstrajecten. Een aanpak als deze stuit vaak op expressie problemen/langdurige werkzaamheden van individuele geselecteerde eiwitten en het efficiënt kunnen spotten van die eiwitten in een mini- of micro-array format. Tevens zou een sequentie-gebaseerde aanpak (design/selectie in silico van de eiwitten op basis van bekende (genoom)sequenties) en kloneringsvrije expressie methode een nieuw scala van studies mogelijk maken.

Resultaten

Binnen het KB/R&D is het afgelopen veel progressie geboekt en zijn een scala aan methoden operationeel geworden die het relatief gemakkelijk maken met verschillende in vitro expressie kits een scala aan eiwitten via een universele methode kloneringsvrij tot expressie te brengen. Een range van eiwitten tot een geteste grootte van tenminste 136 kDa kon via een universele PCR efficiënt worden geamplificeerd (3.8kb) en geëxpresseerd op zodanige wijze van TAGs voorzien dat we kunnen selecteren op volledig eiwit. Ook is een scala aan prokaryote en eukaryote gekoppelde in vitro transcriptie-translatie kits getest. Tevens zijn universele condities die gebruik van dure kits minimaliseren zijn uitgezocht.

Eind 2012 is wel een start gemaakt het geheel op te werken naar een genoom-brede screening van alle ORFs (ORFeome) van een Streptokok. Daarmee kan het project mede bijdragen aan de bestrijding van bedrijfsgebonden dierziekten. Een totale set van ~2.000 ORFs kan geamplificeerd worden middels een 4.000 primers ontworpen middels een ontwikkeld algoritme aan de hand van beschikbaar referentie genoom. Deze primersets blijken in staat meer dan 95% van de genen op te pikken. De expressie van de eiwitten middels het platform is nog in volle gang en resultaten daarvan worden eind 2013 verwacht. We hopen hiermee middels veldsera een set interessante immuun-dominante eiwitten te identificeren geschikt voor diagnostiek en vaccin-toepassingen.