Project

Membraaneiwitten als binders in detectiesystemen

Bioassays zijn meestal gebaseerd op oplosbare eiwitten. Toepassing van membraan eiwitten biedt interessante mogelijkheden, maar is technisch een veel grotere uitdaging. Binnen dit project werkt RIKILT aan technieken om membraaneiwitten toe te kunnen passen in bioassays.

Doelstelling

Doel van het project is het ontwikkelen van innovatieve detectiemethoden voor verontreinigingen in o.a. voedsel en diervoeding. Hiervoor moeten de volgende stappen worden doorlopen
  • Expressie van het membraaneiwit
  • immobilisatiemethoden van het membraaneiwit Ontwikkeling van een SPR-methode voor kleine analyten.
Veel bioassays zijn gebaseerd op oplosbare eiwitten, zoals antilichamen, omdat ze relatief gemakkelijk kunnen worden vervaardigd en toegepast. Membraaneiwitten worden voor dit doeleinde nog nauwelijks gebruikt, omdat ze moeilijk zijn te isoleren en stabiliseren buiten het membraanmilieu. Ze vormen echter wel een aantrekkelijke basis omdat ze veelal aan de basis staan van allerlei cellulaire responsen op aanwezigheid van contaminanten.

Voorbeelden zijn G-eiwit gekoppelde receptoren, ionenkanalen, drugtransporters en enzymgekoppelde receptoren. Om toepassing van deze membraaneiwitten in bioassays mogelijk te maken, moeten geschikte methoden en technieken worden ontwikkeld voor de productie, zuivering, immobilisatie en detectie ervan.

Plan van Aanpak

De onderzoekers hebben β2-adrenoceptor (BAR) als model eiwit gekozen. Deze G-eiwit gekoppelde receptor wordt toegepast voor het screenen van meerdere β2-agonisten en andere onbekende en mogelijk schadelijke stoffen in de voeding. Met een aantal verschillende vormen van BAR, die met behulp van een baculovirus/insectencel expressie systeem worden geproduceerd,  wordt op Surface Plasmon Resonance gebaseerde detectie gebruikt om het immobilisatieproces te volgen en uiteindelijk detectie van β2-agonisten mogelijk te maken.

Resultaten

Om verschillende immobilisatie formats te kunnen testen is het van belang over een goede bron voor het eiwit te beschikken. BAR kan in natieve vorm uit een cellijn worden geïsoleerd, maar is in deze vorm niet stabiel genoeg en bevat bovendien geen affinity-tags die immobilisatie en eventuele zuivering/concentratie zouden kunnen vergemakkelijken. Daarom is gekeken naar alternatieve expressiesystemen en is vervolgens gekozen voor baculovirus/insectencel expressie. In 2012 is gestart met de productie van deze eiwitmoleculen, en is ter controle een bestaande cellijn die deze receptor in hoge mate produceert meegenomen.