Project
Hoge resolutie genotypering van Toxoplasma gondii
Toxoplasma gondii is een van de meest succesvolle parasieten wereldwijd en is in staat om alle warmbloedige vertebraten te infecteren. Er wordt geschat dat ongeveer een derde van de humane wereldbevolking geïnfecteerd is met Toxoplasma.
Zwangere vrouwen en immuun-gecompromitteerde mensen vormen een belangrijke risico groep hoewel gezonde mensen ook geïnfecteerd worden.
Landbouwhuisdieren kunnen ook geïnfecteerd worden met T. gondii. In varkens en runderen verloopt de infectie meest subklinisch, maar in schapen kunnen infecties ook leiden tot abortus. Na infectie worden in landbouwhuisdieren weefselcysten gevormd, die bij de mens tot infectie kunnen leiden na het eten van onvoldoende verhit vlees.
Alleen in katten en katachtigen vindt seksuele vermeerdering van T. gondii plaats in de darmen, gevolgd door de uitscheiding van oöcysten in de feces. Uiteindelijk zal de bestrijding van de infectie in katten en een verminderde uitscheiding van oöcysten bij katten leiden tot een reductie van infecties bij zowel landbouwhuisdieren als de mens.
Tot voor kort werd gedacht dat er weinig genetische variatie te zien zou zijn tussen T. gondii isolaten van hetzelfde type. Recente studies met Type II isolaten uit Zuid Amerika hebben echter laten zien dat door gebruik te maken van bijvoorbeeld multilocus RFLP-PCR technieken verschillende genotypen onderscheiden konden worden. Daarnaast konden isolaten van hetzelfde type (hoewel beperkt) ook verder van elkaar onderscheiden worden door gebruik te maken van multiplex PCR assays waarmee 15 microsatelliet markers worden bestudeerd. Deze studies onderstrepen het belang van goede en hogere resolutie technieken die onderscheid kunnen maken tot op het individuele stamniveau. Tot dusverre is er slechts beperkt gekeken naar de genetische variabiliteit in isolaten afkomstig uit Europa en Zuid-Amerika, mede omdat ook daarvoor de laagdrempelige tools nog ontbreken. Dit project zal daaraan invulling proberen te geven. De binnen dit project ontwikkelde expertise zal worden ingezet voor de ontwikkeling van verbeterde genotyperingstechnieken en toekomstig specifiekere diagnostische testen. Deze testen zullen bijdragen aan het verkrijgen van een beter inzicht in de genetische variabiliteit tussen Nederlandse T. gondii isolaten in internationale context. Dergelijke kennis is van belang voor een beter inzicht in de epidemiologie van toxoplasmose.
De geoptimaliseerd hogere resolutie typering op basis van de bestaande RFLP-PCR of een typering analoog aan bijvoorbeeld de voor Coxiella ontwikkelde hoge resolutie typering. Deze typeringmethode zal vervolgens op een grotere set stammen worden geëvalueerd. Hiervoor zullen referentiestammen van verschillende bronnen gebruikt. Daarnaast zullen Nederlandse stammen reeds verzameld en verzameld tijdens het eerste jaar van dit project uit bv feces van katten, placenta’s van geïnfecteerde schapen, worden geanalyseerd met beschikbaar gekomen methoden.
Landbouwhuisdieren kunnen ook geïnfecteerd worden met T. gondii. In varkens en runderen verloopt de infectie meest subklinisch, maar in schapen kunnen infecties ook leiden tot abortus. Na infectie worden in landbouwhuisdieren weefselcysten gevormd, die bij de mens tot infectie kunnen leiden na het eten van onvoldoende verhit vlees.
Alleen in katten en katachtigen vindt seksuele vermeerdering van T. gondii plaats in de darmen, gevolgd door de uitscheiding van oöcysten in de feces. Uiteindelijk zal de bestrijding van de infectie in katten en een verminderde uitscheiding van oöcysten bij katten leiden tot een reductie van infecties bij zowel landbouwhuisdieren als de mens.
Doelstelling project
De meeste T. gondii isolaten behoren tot de klonale Type I, II en III groepen. Type II isolaten worden vooral geassocieerd met klinische gevallen van toxoplasmose. Er zijn enorme verschillen in virulentie tussen de type I, II en III isolaten. Type I isolaten veroorzaken lethale infecties in alle out-bred muizen zelfs als deze met een lage dosis worden geïnfecteerd (LD100=1). Type II en III stammen zijn echter veel minder virulent (LD50>10*3). In Nederland/Europa en Noord-Amerika komen met name Type II isolaten voor.Tot voor kort werd gedacht dat er weinig genetische variatie te zien zou zijn tussen T. gondii isolaten van hetzelfde type. Recente studies met Type II isolaten uit Zuid Amerika hebben echter laten zien dat door gebruik te maken van bijvoorbeeld multilocus RFLP-PCR technieken verschillende genotypen onderscheiden konden worden. Daarnaast konden isolaten van hetzelfde type (hoewel beperkt) ook verder van elkaar onderscheiden worden door gebruik te maken van multiplex PCR assays waarmee 15 microsatelliet markers worden bestudeerd. Deze studies onderstrepen het belang van goede en hogere resolutie technieken die onderscheid kunnen maken tot op het individuele stamniveau. Tot dusverre is er slechts beperkt gekeken naar de genetische variabiliteit in isolaten afkomstig uit Europa en Zuid-Amerika, mede omdat ook daarvoor de laagdrempelige tools nog ontbreken. Dit project zal daaraan invulling proberen te geven. De binnen dit project ontwikkelde expertise zal worden ingezet voor de ontwikkeling van verbeterde genotyperingstechnieken en toekomstig specifiekere diagnostische testen. Deze testen zullen bijdragen aan het verkrijgen van een beter inzicht in de genetische variabiliteit tussen Nederlandse T. gondii isolaten in internationale context. Dergelijke kennis is van belang voor een beter inzicht in de epidemiologie van toxoplasmose.
Plan van aanpak
Middels de beschikbare referentie genomen zal een bead assay worden ontwikkeld waarmee op Toxoplasma verrijkte monsters een genoom-capture kan worden verricht. Die capture zal vervolgens worden gesequenced met de laatste generatie sequencing technologie teneinde puntmutaties (SNPs) en structurele varianten genoom-breed te detecteren en met stammen te associëren. Differentiële SNPs en structurele varianten liggen dan ten grondslag aan de verder te ontwikkelen hogere resolutie PCR gebaseerde assay. Zo een assay is uitermate interessant om inzicht in de voorkomende stamvariatie binnen Nederland in internationale context te krijgen. Aanvullende stammen als die beschikbaar mochten komen zullen via voorselectie met bijvoorbeeld de bestaande RFLP-PCR worden gecategoriseerd en een representatie zal dan worden geselecteerd uit de verschillende groepen.De geoptimaliseerd hogere resolutie typering op basis van de bestaande RFLP-PCR of een typering analoog aan bijvoorbeeld de voor Coxiella ontwikkelde hoge resolutie typering. Deze typeringmethode zal vervolgens op een grotere set stammen worden geëvalueerd. Hiervoor zullen referentiestammen van verschillende bronnen gebruikt. Daarnaast zullen Nederlandse stammen reeds verzameld en verzameld tijdens het eerste jaar van dit project uit bv feces van katten, placenta’s van geïnfecteerde schapen, worden geanalyseerd met beschikbaar gekomen methoden.