onderzoek in het lab

Project

Ontwikkeling, toepassing en validatie van bioassays

Doel van het project is de ontwikkeling, toepassing en validatie van bioassays, waarmee stoffen op basis van hun effecten worden aangetoond.

In 2012 is een bioassay ontwikkeld die lipofiele mariene biotoxines (DSP’s) kan aantonen. De officiële controle van mosselen op aanwezigheid van mariene toxines geschiedt in veel landen nog altijd met een muizentest. In Nederland is overgeschakeld op een LC/MS-methode, mede omdat er nauwelijks algen lijken voor te komen die toxines produceren en Nederlandse partijen schelpdieren meestal vrij zijn van toxinen. Maar contaminaties met toxinen zijn niet helemaal uitgesloten, zoals blijkt uit een recent aangetroffen toxine-producerende dinoflagellaat in een kreek die loost op de Oosterschelde, een van de belangrijkste productiegebieden.

Voor geïmporteerde partijen geldt zeker dat er een risico bestaat op onbekende toxines, die kunnen worden gemist met een LC-MS-methode (vaak door gebrek aan standaarden). In de EU-regelgeving is om die reden het gebruik van bioassays met dieren voor controle van productiegebieden, ook na 2015, niet verboden. Dit probleem kan worden ondervangen met in vitro bioassays die de aanwezigheid van marine toxines op basis van hun werking kunnen aantonen. Meer algemeen zouden dergelijke testen ook kunnen worden ingezet bij incidenten met nog onbekende oorzaak of onbekende pakketjes (ondersteuning binnen LLN-TA). Om die reden is het onderzoek inmiddels uitgebreid naar mycotoxines en zullen in de toekomst ook andere toxines bekeken worden.

In Europees verband wordt gewerkt aan regels voor validatie van bioassays voor dioxines en dioxine-achhtige PCB's. Hervalidatie van de DR CALUX-assay op basis van de nieuwe regelgeving is daarom gewenst.

Aanpak en tijdspad

Validatie en aanpassen protocollen CALUX-assay voor dioxines op basis van nieuwe EU-Verordening

Een werkgroep binnen het EURL/NRL-netwerk heeft recent de performance criteria voor dioxine-analyses aangepast. Deze Verordening is in 2012 van kracht geworden. Alhoewel de methode van het RIKILT grotendeels voldoet aan de nieuwe Verordening moesten er een paar punten worden aangepast in de SOP's. Ook moesten op basis van de nieuwe aanbeveling een aantal validaties herhaald worden. Deze werkzaamheden zullen eind 2012 en begin 2013 worden afgerond en de wijzigingen zullen worden voorgelegd aan de RvA.

Ontwikkeling bioassay voor mariene toxines

Om de test verder te valideren worden onbesmette en besmette schelpdierpartijen, de laatste veelal verkregen uit het buitenland, getest en vergeleken met LC/MS-analyses. Ook de specificiteit en robuustheid van de test zal worden bekeken (bijv. respons van PSPs). In 2013 zullen de huidige werkzaamheden worden afgerond.

Ontwikkeling bioassays voor mycotoxines

Er is momenteel veel aandacht voor nieuwe mycotoxines en gemaskeerde vormen van reeds bekende toxines. Ook hier kunnen effectassays een belangrijke rol spelen. In 2013 zal daarom ook gewerkt worden om de multiplex PCR-techniek ook te gebruiken voor de detectie van (onbekende) mycotoxines.

Resultaten

  • Aangepaste SOP's en hervalidatie voor het screenen van monsters op dioxines met behulp van de DR CALUX bioassay. Bioassays zijn vooral bedoeld om een kwalitatieve uitspraak te doen. Een eventuele inschatting van het gehalte in monsters is met name de taak voor het laboratorium dat de bevestiging moet uitvoeren.
  • Merkergenen zijn geselecteerd voor de gereguleerde DSP's. Op basis van deze merkergenen is er een unieke snelle multiplex qRT-PCR-methode ontwikkeld voor de gereguleerde DSP's. Daarmee kan op dit moment van 4 genen tegelijk de genexpressie worden bekeken, ofwel de aanmaak van messenger RNA door de blootgestelde cellen.

  • Een in vitro multiplex PCR-methode en een bijbehorend testprotocol voor het aantonen van DSP's in schelpdieren, met een bewezen effectiviteit voor het aantonen van DTX, AZA, OA, PTX en YTX in mosselen.
  • Een in vitro multiplex PCR-methode en een bijbehorend testprotocol voor het aantonen van mycotoxines in mais en granen, met een bewezen effectiviteit voor type A en type B trichothecenen en ochratoxine A.

    Publicaties